일시적으로 확인된 SMLM(큰 PAR 이동 포함)을 통해 라이브 셀에서 동적 HA 클러스터 형성 및 마이그레이션을 시각화할 수 있습니다.

Jul 23, 2023

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 12561(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

단일 분자의 깜박임 특성은 단일 분자 국소화 현미경(SMLM)에 매우 중요합니다. 일반적으로 SMLM 기술에는 깜박이는 기간에 가까운 검출기 노출 시간을 사용하여 단일 분자의 회절 제한 밝은 점의 여러 프레임을 기록하는 작업이 포함됩니다. 이는 SMLM의 시간적 해상도 제한을 수십 밀리초로 설정합니다. 단일 분자의 상당 부분이 평균 깜박임 기간보다 훨씬 짧은 시간 동안 광자를 방출한다는 사실을 인식하여 이러한 빠른 방출자를 캡처하기 위해 데이터 수집을 가속화할 것을 제안합니다. 여기에서는 동적 이벤트(단일 분자 및 앙상블 수준 모두)를 이해하기 위해 sCMOS 검출기로 구동되는 짧은 노출 기반 SMLM(shortSMLM) 방법을 제시합니다. 이 기술은 NIH3T3 세포(고정 세포와 살아있는 세포 모두)가 Dendra2-HA 플라스미드 DNA에 의해 형질감염된 인플루엔자-A 질병 모델에서 입증되었습니다. 분석 결과, 표준 SMLM에 비해 공간 분해능이 희생되면서 시간 분해능이 2.76배 향상되었으며, 입자 분해능 이동 PAR-shift(위치 파악 정밀도 기준) \(\sim\) 11.82 nm가 나타났습니다. 우리는 DNA 형질감염 24시간 후 형질감염된 세포에서 동적 HA 클러스터 형성을 시각화했습니다. 공간 분해능의 감소는 클러스터 특성(클러스터 밀도, \(\#\) 분자/클러스터, 클러스터 확산 등)을 실질적으로 변경하지 않으며 실제로 중요한 기능을 유지한다는 점에 유의하십시오. 더욱이, 저속 촬영 영상은 살아있는 세포에서 헤마글루티닌(HA) 클러스터의 동적 형성과 이동을 보여줍니다. 이는 동기화된 높은 QE sCMOS 검출기(짧은 노출 시간에서 작동)를 사용하는 \(short-SMLM\)가 셀룰러 시스템의 시간 역학을 연구하는 데 탁월하다는 것을 의미합니다.

표준 단일 분자 국소화 현미경(SMLM) 기술(fPALM1, STORM2, PALM3, IML-SPIM4, MINFLUX5,6, dSTORM7, SOFI8, ROSE9, SMILE10,11, POSSIBLE12 및 변형13,14,15,16,17)은 일반적으로 수천 개의(\(> 10^{3}\) ) 단일 분자 이미지를 사용하여 단일 초해상 이미지를 재구성합니다. 이는 일반적인 카메라 노출 및 판독 시간보다 상당한 획득 시간을 차지합니다. 전반적인 시간적 해상도를 가속화하려면 데이터 수집을 가속화해야 합니다. 그러나 분자의 형광주기 시간으로 인해 시간적 분해능에는 한계가 있습니다18. 최근에는 빠르게 깜박이는 분자, 높은 여기 강도, 어두운 상태 및 sCMOS 카메라를 사용한 연구는 거의 없습니다. 다른 연구에서는 계산 기술을 사용하여 획득 시간을 줄이는 것이 가능성을 보여주었습니다. 인공 지능과 결합된 빠른 컴퓨팅 엔진(FPGA-GPU 및 CUDA)을 사용하는 다른 기술은 SMLM24,25,26,27에서 큰 잠재력을 보여주었습니다. 이러한 기술은 도움이 되지만 광표백이 발생하기 쉽습니다. 여기에서는 빠르게 깜박이는 형광 단백질(Dendra2)을 캡처하기 위한 고급 sCMOS 기술을 기반으로 하는 신속한 데이터 수집에 대해 논의합니다. ON/OFF 시간에 따른 Dendra2의 깜박임 동작은 Avilov et al28에 의해 자세히 연구되었습니다. 빠른 컴퓨팅 엔진과 함께 빠른 획득 기술은 강력한 조합이며 실시간 초해상도 이미징을 가능하게 할 가능성이 더 높을 것으로 예상됩니다.

지난 몇 년 동안 이 방향에서 상당한 진전이 있었고 많은 연구 그룹이 이 문제를 다루었습니다. 뚜렷한 접근법은 강도 및 기타 실험 매개변수를 변경하지 않고 프레임당 활성 단일 분자의 수를 늘리는 것입니다. 그러나 이 기술에는 대규모 활성화로 인해 단일 분자의 회절 제한 시그니처가 겹쳐 개별 분자를 구별할 수 없게 되고 결과적으로 복잡성이 증가할 수 있는 비용이 발생합니다. Lin 등의 최근 연구. Alexa Fluor 647-염료를 사용하여 면역표지된 미세소관의 이미지 품질을 정량적으로 비교했습니다. Diekmann et al.의 또 다른 연구. 두 가지 중요한 요소(즉, 현지화 정밀도 및 라벨링 효율성)가 SMLM 이미지 품질을 결정한다는 것을 보여주었습니다. 그들은 다양한 라벨링 효율성과 강도에서 다양한 염료(AF647, CF680, CF660C, Dy634)에 대한 이미지 품질에 대한 속도의 결과를 체계적으로 조사했습니다. 우리가 아는 한, Dendra 2와 같은 광전환 가능 단백질은 빠른 이미징 및 시간 경과 국소화 현미경에 대해 입증된 적이 없으므로 초고해상도 현미경에 사용되는 중요한 종류의 프로브를 나타냅니다. 특히, 광전환 가능 단백질은 관심 단백질과의 복제/접합을 허용하므로 생물학적 과정(예: 질병 진행31,32,33)을 연구하는 데 적합하고 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이 됩니다.